BILIGECT – Biopsie liquide per la Gestione Clinica dei Tumori

BiLiGeCT, progetto finanziato dal Programma PON (www.ponricerca.gov.it) prevede 5 linee di ricerca per lo sviluppo di marcatori circolanti, mediante biopsia liquida, per la prevenzione, diagnosi e terapia dei tumori sia ereditari che sporadici:

1. diagnosi precoce di malattia in soggetti sani BRCA mutati a rischio genetico di tumori della mammella/ovaio per lo sviluppo di saggi diagnostici altamente sensibili ed economici;
2. diagnosi precoce di ripresa di malattia in soggetti BRCA mutati con storia pregressa di tumore della mammella/ovaio in sorveglianza con l’impiego di marcatori circolanti per monitorare la malattia e l’adeguato uso della terapia;
3. diagnosi precoce di tumori di polmone e prostata per lo sviluppo di nuovi marcatori esosomiali circolanti per una diagnosi di malattia più efficace e meno invasiva;
4. scelta delle terapie di seconda linea ed oltre nei tumori del colon-retto mediante biopsia liquida;
5. sviluppo di innovativi test cellulari per lo screening di nuovi farmaci o il riposizionamento di farmaci noti per le mutazioni rilevate con biopsia liquida. Inizialmente, sarà testata la sensibilità ai PARP inibitori di alcune varianti BRCA a significato funzionale ignoto (VUS).

Codice progetto:

RISULTATI ATTESI:
L’obiettivo del Progetto è sviluppare originali tools diagnostici per la gestione dei tumori, che abbiano dei significativi benefici per i pazienti in un misurabile contesto di sostenibilità economica, basandosi sull’approccio innovativo della “biopsia liquida”. La biopsia liquida, per le sue caratteristiche di non invasività e per la possibilità di una raccolta multipla nel tempo di campioni da fluidi biologici da esaminare, rappresenta al momento l’unica alternativa possibile agli approcci strumentali, attualmente usati, per una diagnosi precoce tumorale come evento primario e come ripresa di malattia. Caratteristica della biopsia liquida è quella di presentare diverse opzioni relativamente al materiale biologico da analizzare per identificare gli opportuni biomarcatori. Per questo scopo si può esaminare il DNA libero circolante o anche miRNA circolanti.

RISULTATI RAGGIUNTI

Il cancro al seno è il tumore più comune nelle donne di tutto il mondo. Si differenzia per caratteristiche istologiche e molecolari che, a loro volta, influenzano l'esito clinico e la risposta alla terapia delle pazienti. La maggior parte dei tumori alla mammella deriva da mutazioni genetiche ed epigenetiche somatiche, mentre circa il 5% è causato da mutazioni germinali. BRCA1 e BRCA2, coinvolti nella riparazione del DNA, sono i geni più frequentemente mutati e associati a un aumento fino al 75% del rischio di insorgenza del tumore al seno. Questi tumori, inoltre, sono caratterizzati da un fenotipo più aggressivo rispetto ai tumori sporadici. Pertanto, la definizione precisa e l'individuazione di pazienti con BC mutati in BRCA1 o 2 dovrebbero meritare un'attenzione particolare. Le biopsie tissutali e il successivo esame patologico dei tessuti sono procedure consolidate per la caratterizzazione istologica e molecolare dei tumori. Tuttavia, sono invasive e spesso inducono disagio nei pazienti. Sulla base di queste considerazioni, l'importanza della biopsia liquida sia per la diagnosi che per la definizione molecolare dei tumori, è in continuo aumento.Le modificazioni epigenetiche, come la metilazione, sono considerate un segno distintivo del cancro e si riscontrano nelle fasi iniziali della malattia, nella progressione del tumore e nella formazione di metastasi per la scelta migliore della terapia e la corretta gestione clinica dei pazienti. Lo studio del profilo di metilazione circolante nei pazienti oncologici può essere effettuato grazie alla presenza di DNA libero circolante (cfDNA) nel plasma. Il cfDNA comprende piccoli frammenti con una dimensione media di 167 bp rilasciati nel flusso sanguigno da cellule normali e tumorali. In tale contesto si inserisce l’immunoprecipitazione di DNA metilato e high-throughput sequencing (cfMeDIP-seq), una metodica innovativa e ad alta sensibilità che permette l’analisi di regioni metilate di cfDNA metilato mediante anticorpi anti-5mC e dal successivo sequenziamento ad alto rendimento (cfMeDIP-seq).

Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare se, mediante cfMeDIP-seq, la metilazione del cfDNA nei portatori di mutazioni germinali in BRCA1 e BRCA2 potesse configurarsi come un biomarcatore per la diagnosi precoce.

La metodica cfMeDIP è stata messa a punto e prevede i seguenti passaggi: Isolamento del plasma da sangue intero, estrazione del DNA cell-free (cfDNA), costruzione del DNA λ filler, preparazione delle librerie, fase di immunoprecipitazione(MeDIP) e Sequenziamento (NGS). Nel presente studio, abbiamo arruolato 23 pazienti BC con mutazioni germinali dei geni BRCA1/2, 19 controlli sani senza mutazioni BRCA1/2 e due individui sani portatori di mutazioni BRCA1/2. Il DNA libero da cellule è stato estratto da 1 ml di plasma e per ogni campione è stato eseguito la cfMeDIP-seq. Sui campioni immuno-precipitati è stato eseguito il sequenziamento dell'intero genoma. Quindi, sono state identificate le regioni a 300 bp differenzialmente metilate (DMR) tra 25 portatrici di mutazioni germinali BRCA e 19 non portatrici. Abbiamo identificato 7.095 regioni ipermetilate e 212 ipometilate in 25 portatori di mutazioni germinali BRCA rispetto a 19 controlli. Come convalida delle regioni differenzialmente metilate identificate nel cfDNA, abbiamo riportato che tali regioni possono distinguere i tessuti mammari TCGA BRCA dai controlli sani con un'elevata accuratezza. Inoltre, sono stati addestrati due classificatori statistici basati sul modello GLMnet e random forest che hanno discriminato tra BRCA positivi e campioni sani con un AUC di 0,95, una sensibilità dell'88% e una specificità del 94,74%. Infine, abbiamo riscontrato che il DNA tumorale circolante dei tumori al seno BRCA1/2 mutanti è caratterizzato dall'ipometilazione di geni coinvolti nella riparazione del DNA e nel ciclo cellulare (Rad50, ATR, ATM, FANCA, PARP4).

Il nostro studio sottolinea l'importanza della metilazione del DNA derivata dalle cellule tumorali nel cancro al seno, riportando un diverso profilo di metilazione tra le pazienti portatrici di mutazioni in BRCA1, BRCA2 e controlli sani. Il nostro approccio minimamente invasivo potrebbe quindi consentire una diagnosi precoce del cancro al seno.

Partners del progetto BiLiGeCT: